實驗室 作業(yè)指導書 文件編號：SWAQ-PCR-3-2018

　第 第 A 版

　編制：

　沈龍華

　審核：

　魯君艷

　批準：

　姜志剛

　生效日期：2018 年 年 05 月 月 05 日 永州市中心醫(yī)院南院檢驗科

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：AQSC-PCR-3-2018

　版本/修訂號：A/0 主題內容 目 錄 生效日期：20180505

　第 2 頁， 共 37 頁

　 目

　 錄 章節(jié) 名

　稱 頁碼 01 目錄 2 02 修訂頁 3 03 實驗室工作流程標準操作程序 4 04 標本接收/拒收標準操作程序 5 05 實驗室標本處理標準操作程序 6 06 實驗耗材消毒標準操作程序 7 07 實驗室清潔消毒標準操作程序 8 08 PCR 擴增儀標準操作程序 9 09 生物安全柜標準操作程序 12 10 乙型肝炎病毒核酸定量檢測標準操作程序 14 11 腸道病毒 71 型核酸檢測標準操作程序 18 12 丙型肝炎病毒 RNA 檢測標準操作程序 22 13 高危型人乳頭瘤病毒 DNA 檢測標準操作程序

　26 14 肺炎支原體 DNA 檢測標準操作程序

　31 15 沙眼衣原體 DNA 檢測標準操作程序

　34

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　作業(yè)指導書

　 文件編號：AQSC-PCR-3-2015

　版本/修訂號：A/0 主題內容 修訂頁 生效日期：20151010

　第 3 頁， 共 37 頁 修訂頁

　序號 修訂內容 批準人 修訂時間

　 永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR01001 版本/修訂號：A/0 主題內容 工作流程標準操作程序

　生效日期：20151010

　 第 4 頁 共 37 頁 臨床基因擴增實驗室工作流程標準操作程序

　目的：規(guī)范臨床擴增實驗室日常工作流程，確保實驗室各項操作的標準化，規(guī)范化 范圍：臨床基因擴增實驗室 日常工作流程：

　 一、標本處理流程 1.1、掃碼接收：標本經標本接收室掃條碼核收后進入臨床基因擴增實驗室 1.2、標本編號：對所有標本進行編號處理，并按次序做好標識；在 LIS 系統(tǒng)中對標本掃條碼或手工編號建檔，仔細核對每一標本及其相對應的化驗申請單或標本條碼標簽上的信息：患者姓名、科別、床號，檢驗項目及標本質量 1.3、標本處理：

　1.3.1

　血液標本 3000 轉/分離心 5 分鐘，吸取上清液于 1.5ml 滅菌離心管內待檢（如非當日檢測標本則需放于-20℃冷凍冰箱保存）。

　1.3.2

　分泌物或咽拭子標本加 1ml 生理鹽水后于振蕩器上振蕩混勻一分鐘，吸取上清液于1.5ml 滅菌離心管內待檢（如非當日檢測標本則需放于-20℃冷凍冰箱保存）。

　1.3.3

　乳汁標本 3000 轉/分離心 5 分鐘，吸取上清液于 1.5ml 滅菌離心管內待檢（如非當日檢測標本則需放于-20℃冷凍冰箱保存）。

　1.4、將上述標本進行擴增實驗前預處理后進行擴增實驗。

　二、 檢測流程 2.1、實驗室環(huán)境檢查，做好相應的溫度、濕度記錄 2.2、儀器檢查及維護并做好相應記錄 2.3、準備實驗所需的試劑、耗材 2.4、檢測標本擴增前預處理 2.5、將預處理好的標本按要求放于擴增儀上，按相應程序進行基因擴增 2.6、擴增結束后，審核實驗結果，發(fā)出實驗報告 2.7、整理工作臺面，做好檢測后儀器維護保養(yǎng)工作 三、結果報告流程

　 分析核準檢驗結果：分析當日檢測標準曲線，內標、陰陽性對照、質控及標準品等結果是否符合要求；反應曲線是否正常；檢測結果是否異常需要復查。如無誤則對當日各檢驗結果進行核準，發(fā)出檢測報告。否則進行復查等處理 四、檢測結束工作流程 4.1 當日檢驗結束后關閉儀器及水源、電源，整理工作臺面，對各項設備進行日維護保養(yǎng) 4.2 將已檢驗標本做好日期標記后放入已檢測標本存儲冰箱，放置一周后再交衛(wèi)生員處理 SOP 文件的更改

　 該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

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　 文件編號：JYKPCR01002 版本/修訂號：A/0 主題內容 標本接收/ / 拒收標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 5 頁 共 37 頁 臨床基因擴增實驗室標本接收/ / 拒收標準操作程序

　一、 目的：規(guī)范臨床擴增實驗室標本的接收與拒收工作，做好檢測前質量控制。

　二、 范圍：臨床基因擴增實驗室

　三、 標本接收程序內容

　標本經標本接收室掃條碼核收送至實驗室后，由實驗人員驗收。驗收要求有：

　3.1 標本唯一性是否正確無誤，即標本是否貼有條碼及條碼是否清晰或標本標簽與申請單標

　 簽是否相符 3.2 申請檢驗項目與標本是否相符合 3.3 標本采集保存容器是否正確、容器有無破損 3.4 檢查標本的外觀是否異常（包括:有無溶血、有無乳糜狀、抗凝血標本中有無凝塊等及標

　 本量是否足夠）。

　3.5 檢查標本采集時間與接收時間之間的時間間隔是否符合要求 3.6 如果標本不符合驗收要求，則對標本進行拒收

　四、 標本拒收程序內容

　 如在標本驗收中發(fā)現有以下不符合要求項時，則對此標本進行拒收，將其退回該標本的送檢科室及送檢者，要求重新采集標本送檢 4.1 唯一性標志錯誤或條碼、標簽不清晰以及標簽有脫落的標本 4.2 用錯標本容器（如用錯真空采血管等）或容器有破損的標本 4.3 溶血標本，乳糜血標本 4.4 抗凝血有凝塊標本，未按要求抗凝標本 4.5 標本量不足的標本 4.6 未按標本保存要求進行送檢前保存的標本 4.7 采集標本時間距送檢時間過長而未達到要求的標本

　五、 注意事項 5.1 標本接收驗收與拒收工作實際上是實驗室對送檢驗標本外在質量的把關，是做好檢測前質量控制重要的一個環(huán)節(jié)。

　5.2 標本接收驗收情況要做好記錄，標本不合格的情況要及時反饋給申請科室。如有標本回退困難或標本重新采集困難的情況時，應與申請醫(yī)生直接聯(lián)系，告知標本不合格情況，如臨床醫(yī)生仍要求對此標本進行檢測，應告知此不合格標本對檢測結果造成的影響，并在檢驗報告做出相應的文字說明，并對以上情況做好記錄。

　六、SOP 文件的更改 該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

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　 文件編號：JYKPCR01003 版本/修訂號：A/0 主題內容 標本處理標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 6 頁 共 37 頁 臨床基因擴增實驗室標本處理標準操作程序

　一、 目的：擴增實驗標本經驗收合格后，需要經過一系列的處理，才能進行擴增實驗檢測。

　 本程序規(guī)范臨床擴增實驗室標本擴增實驗前的處理。

　二、 范圍：臨床基因擴增實驗室

　三、 標本檢測前處理規(guī)程內容 3.1

　DNA 擴增檢測標本（HBV-DNA）：

　3.1.1 血液標本：標本經驗收合格后，立即放入 37℃水浴箱溫育 10 分鐘，然后 3000 轉/分鐘離心 5 分鐘，取血清 500ul，加入 1.5ml 滅菌離心管內，于－20℃±5℃保存（不超過 3個月，如超過 3 個月，需－70℃保存）； 3.1.2 乳汁標本：標本經驗收合格后，立即 3000 轉/分鐘離心 5 分鐘，取上清 500ul，加入 1.5ml 滅菌離心管內，于－20℃±5℃保存（不超過 3 個月，如超過 3 個月，需－70℃保存）

　3.2

　RNA 擴增檢測標本：

　3.2.1 HCV-RNA 檢測標本：標本經驗收合格后，立即放入 37℃水浴箱溫育 10 分鐘，然后 3000 轉/分鐘離心 5 分鐘，取血清 500ul，加入 1.5ml 滅菌離心管內，于－20℃±5℃保存（不超過 3 個月，如超過 3 個月，需－70℃保存）； 3.2.2

　EV-71 RNA 檢測標本：本檢測標本類型為咽拭子。咽拭子標本經掃碼核收后，加入 1ml 生理鹽水，充分振蕩（振蕩儀振蕩 1 分鐘），取 500ul 溶液標本，加入 1.5ml 滅菌離心管內，于－20℃±5℃保存（不超過 3 個月，如超過 3 個月，需－70℃保存）

　3.3 上述離心標本如在 2 小時內檢測，則不需冷凍保存； 冷凍標本檢測前需解凍復溶，可于 37℃水浴箱溫育 5 分鐘復溶，避免反復凍溶。

　四、SOP 文件的更改 該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

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　 文件編號：JYKPCR01004 版本/修訂號：A/0 主題內容 耗材消毒標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 7 頁 共 37 頁 臨床基因擴增實驗室 實驗耗材消毒標準操作程序

　一、目的：規(guī)范臨床擴增實驗室擴增實驗耗材消毒工作。

　二、 范圍：臨床基因擴增實驗室

　三、實驗耗材消毒內容 3.1 消毒耗材詳單：1.5ml 離心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、擴增反應管（帶蓋）

　3.2 消毒前準備：

　3.2.1 將離心管、反應管分別裝于消毒盒內

　3.2.2 將吸嘴按 10ul、200ul、1000ul 分別裝于吸嘴盒內 3.3 消毒：高壓滅菌鍋 121℃，30 分鐘高壓滅菌 3.3.1 確保高壓滅菌鍋狀態(tài)正常，加水，確認水位在水位刻度以上 3.3.2 將分裝好耗材的各消毒盒放于高壓滅菌鍋內，依次擺好 3.3.3 插上電源插頭，打開放氣閥和安全閥閥門，待高壓滅菌鍋上氣后排氣 5 分鐘 3.3.4 關閉放氣閥和安全閥閥門，待氣壓指示針達到刻度 115 時開始計時 3.3.5 當氣壓指示針達到 121 時，拔下電源插頭；當氣壓指示針即將達到刻度 115 時插上

　電源插頭；如此循環(huán) 30 分鐘。

　3.4 消毒后處理：將高壓滅菌后的消毒盒、吸嘴盒放于烤箱內烤干備用 3.5 備注：高壓滅菌鍋在微生物實驗室。

　四、SOP 文件的更改 該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

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　 文件編號：JYKPCR01004 版本/修訂號：A/0 主題內容 清潔消毒準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 8 頁 共 37 頁 臨床基因擴增實驗室清潔消毒標準操作程序

　一、目的：規(guī)范臨床擴增實驗室清潔消毒工作。

　二、 范圍：臨床基因擴增實驗室

　三、清潔消毒內容 3.1 擴增實驗開始前，整理實驗室工作臺面，搞好實驗室衛(wèi)生 3.2 對生物安全柜進行紫外燈消毒一小時，同時用紫外燈對擴增區(qū)進行消毒一小時 3.3 擴增實驗過程中按要求進行操作，防止污染發(fā)生 3.4 生物安全柜內操作結束后，立即進行紫外燈消毒一小時 3.5 擴增實驗結束后，整理工作臺面，搞好實驗衛(wèi)生 3.5.1

　做好生物安全柜的清潔工作：用 75%酒精（嚴禁用次氯酸鈉）對生物安全柜各表面進行擦洗 3.5.2

　次氯酸鈉溶液擦工作臺面 3.5.3

　清潔擴增儀表面 3.6

　對實驗室進行紫外燈消毒一小時 3.7

　開窗，做好實驗室通風

　 四、SOP 文件的更改 該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

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　 文件編號：JYKPCR02001 版本/修訂號：A/0 主題內容 N SLAN 擴增儀標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 9 頁 共 37 頁 SLAN＠ 熒光定量 R PCR 擴增儀標準操作程序

　一、目的：規(guī)范 SLAN＠ 熒光定量 PCR 擴增儀的標準操作。

　二 、范圍：臨床基因擴增實驗室 三、責任人要 求：經過培訓考核合格的臨床擴增實驗室工作人員 四、儀器廠家：上海宏石醫(yī)療科技有限公司 五、檢測原理：

　SLAN ® 熒光定量 PCR 擴增儀集 PCR 擴增（重復循環(huán) PCR 三個基本反應步驟：變性-退火-延伸三過程，1～2 小時將待測目標基因擴增放大）、熒光檢測（在 PCR 反應系統(tǒng)中加入一個熒光標記探針，激發(fā)的熒光信號值與所擴增的目標基因數量成正比，通過對試管內熒光值的實時監(jiān)測，來實現模板的定量檢測）于一身，實時監(jiān)測每個試管內熒光量的增長過程，在擴增結束后，系統(tǒng)通過軟件對實驗數據自動進行分析，繪制標準曲線，顯示每個標本的起始濃度等實驗結果。

　六、 標準操作：

　6.1 開機前檢查：整理擴增儀臺面，保持實驗室環(huán)境穩(wěn)定、儀器表面清潔，電源穩(wěn)定 6.2 開機自檢：打開電源開關及 LIS 電腦，等待儀器自檢，自檢完成后，打開工作軟件。

　6.3 實驗樣品上機：點擊“熱蓋”選項，等待擴增儀自動熱蓋完成后，推開位于儀器上方的蓋子，即將蓋子按其軌道往后推。將實驗樣品按次序放入加熱模塊，關閉儀器蓋子。

　6.4 擴增檢測設置：

　6.4.1 文件設置：打開工作軟件，點擊左上方的“新建文件”按鈕，選擇新建一個 PCR 文

　 件，點擊“確定”鍵，在彈出的對話框中選擇通道，點擊“確定”。

　6.4.2 板面設置：點擊“模板編輯”后，選中所放樣品位置對應的孔，鼠標點擊右鍵，

　 進行樣品類型的選擇：

　6.4.2.1 已知標準品設為標準品，點擊“檢驗項目”，在下拉菜單中選擇 HBV，在屬性一

　 欄輸入具體的濃度值，點擊“確定”保存；

　6.4.2.2 待測樣本設為樣品，點擊“檢驗項目”，在下拉菜單中選擇 HBV，點擊“確定”

　 保存； 6.4.2.3 陽性對照，陰性對照及質控品分別選擇相應的選項，點擊“確定”保存 6.4.3 擴增程序選擇：點擊“基因擴增”，進入基因擴增版面，點擊屏幕右方的“打開”

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　 文件編號：JYKPCR02001 版本/修訂號：A/0 主題內容 N SLAN 擴增儀標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 10 頁 共 37 頁

　按鈕，選擇已經設置好的程序名稱，打開即可。

　6.5 運行：設置完成后，點擊“開始實驗”按鈕，儀器會提示是否要開始，點擊“確定”。

　6.5 數據分析：

　 程序運行結束（儀器提示：“正常運行結束”）后，所有的數據儀器會自動給出。

　點擊“實驗結果”按鈕，進入分析界面，即可顯示所有反應管的樣品名及濃度值。結合實驗結果版面下的“模板模式”、“擴增曲線”、“標準曲線”、“報告模式”下數據，綜合分析實驗結果，發(fā)出實驗報告 6.6 關機 實驗運行及分析完成后，點擊“工具”按鈕，在下拉菜單中點擊“打開熱蓋”，待儀器打開后，即可向后推開蓋子，取出已擴增反應管。關閉擴增儀及 LIS 電腦，整理清潔擴增儀臺面。

　七、 儀器保養(yǎng)與維護

　7.1 儀器清潔：每周一檢測結束后，關閉擴增儀并拔掉電源線，用軟布沾清水擦洗（擦洗后一定要將儀器擦干），注意一定不能用化學劑用有機溶液清洗。用濕棉纖將縫隙中的灰塵清除。

　7.2 反應孔清潔：反應孔沾染灰塵或雜質后，會影響 PCR 擴增和熒光檢測。每三個月清潔一次反應孔，即用吹氣球輕輕吹拭反應孔。儀器不使用時必須關閉上蓋，并套上防塵罩。

　7.3 儀器保護：

　7.3.1 不能頻繁開關擴增儀，兩次開關間隔時間必須超過 1 分鐘； 7.3.2 一次實驗結束后，模塊往往還有較高溫度，不能立即關閉擴增儀電源，應讓風扇繼續(xù)運行三十分鐘后，當模塊溫度下降至室溫時再關閉擴增儀電源開關或進行下一次實驗。

　7.3.3 擴增儀的控溫范圍為 4-99℃，禁止在擴增儀上進行沸水浴和低溫保溫操作。

　7.3.4 實驗室工作人員禁拆卸擴增儀。如有需要，請聯(lián)系廠家工程師進行拆卸操作。

　7.3.5 更換保險絲：擴增儀裝有兩個 5.0A 保險絲。當保險絲損壞后，工作人員應知曉保險絲的更換：切斷主機電源并拔掉電源線，用一字螺絲刀逆時針擰開機廂后方保險絲盒蓋，更換保險絲（保險絲型號：Φ5×20mm-5A、250V），再蓋好保險絲盒蓋，最后插上電源線。

　八、 附錄：

　8.1 儀器組成部分 ：

　 永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR02001 版本/修訂號：A/0 主題內容 N SLAN 擴增儀標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 11 頁 共 37 頁

　計算機系統(tǒng)、控制部件、熱蓋部件、熱循環(huán)部件、光電檢測部件、傳動部件、電源部件等。

　8.2 主要結構示意圖：

　8.3 儀器面板標識：

　8.4 使用要求：

　電源 220V（±10%）

　、50Hz

　 操作環(huán)境溫度 10 ～ 30 ℃

　 功率 < 500VA

　操作環(huán)境相對濕度 20 ～ 80% 8.5 系統(tǒng)性能：

　樣品容量 48 孔 × 0.2ml

　 激發(fā)濾光片

　470nm、530nm、630nm（585nm）

　樣品容積 20 ～ 50µl

　 發(fā)射濾光片

　510nm、565nm、665nm（620nm）

　控溫范圍 4 ～ 99 ℃

　 靈敏度

　最小分辨率為 1 個拷貝

　重復性 CV< 1.5%

　 線性范圍 10 0 ～ 10 10 個拷貝 檢測探針或染料

　FAM、SYBR、HEX、JOE、VIC、TET、ROX、TEXRD、CY5 8.5 聯(lián)系方式：021-65107515 9 9 、P SOP 文件的更改

　該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

　 前面板指示燈：

　后面板：

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR02002 版本/修訂號：A/0 主題內容 生物安全柜標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 12 頁 共 37 頁 生物安全柜標準操作程序

　一、目的：規(guī)范生物安全柜的操作與維護保養(yǎng)工作，確保設備的正常運作，以保障操作人員的安全。

　二 、范圍：臨床基因擴增實驗室 三、責任人要求：經過培訓考核合格的臨床擴增實驗室工作人員 四、儀器品牌型號：

　BIOBASE，BHC-1100IIA2（II 級 A2 型）

　五、儀器廠家：濟南鑫貝西生物技術有限公司 六、工作原理：

　生物安全柜的工作原理主要是將柜內空氣向外抽吸，使柜內保持負壓狀態(tài)，安全柜內的氣體不能外泄從而保護工作人員；外界空氣經高效空氣過濾器過濾后進入安全柜內，以避免處理樣品被污染；柜內空氣也需經過高效空氣過濾器過濾后再排放到大氣中以保護環(huán)境。

　II 級 A2 型生物安全柜：前窗操作口流入氣流最小平均流速為 0.5m/s；柜內 70%氣體通過高效空氣過濾器過濾后再循環(huán)至工作區(qū)，30%氣體通過排氣口高效空氣過濾器過濾后排出； 安全柜內的污染氣流經過高效空氣過濾器過濾后經過生物安全柜的外排接口通過排風管排到大氣中。

　 七、標準操作：

　7.1 開機前先接通電源線，用鑰匙打開生物安全柜的開關，按下電源按鈕“Power supply”，電源指示燈亮 7.2 使用前，關閉前玻璃窗，按下進風開關按鈕“Wind-in motor”、排風開關按鈕“Wind-out motor”和紫外燈消毒開關按鈕“Disinfect switch”,三個指示燈亮，消毒 30 分鐘。

　7.3 按下紫外燈消毒開關按鈕“Disinfect switch”，此燈滅，關閉紫外燈。按下照明燈開關按鈕“Light switch”,照明指示燈亮，照明燈亮。打開前玻璃窗口，高度不能超過 20 厘米（超過即安全柜發(fā)出報警音）。

　7.4 使用時，將實驗相關物品依次擺放于生物安全柜內，雙臂緩緩伸入安全柜內，至少靜止2min，使柜內氣流穩(wěn)定后再進行操作；操作時保證操作人員的臉部在工作窗口之上。在柜內操作時動作應輕柔、舒緩，防止影響柜內氣流。

　7.5 操作完成后，關閉玻璃視窗，保持進風與排風繼續(xù)運轉，按下照明燈開關按鈕“Light switch”，關閉照明功能，關燈；同時按下紫外燈消毒開關按鈕“Disinfect switch”，打

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

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　 文件編號：JYKPCR02002 版本/修訂號：A/0 主題內容 生物安全柜標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 13 頁 共 37 頁 開紫外燈，消毒 30min。

　7.6 消毒結束后，按下進風開關按鈕“Wind-in motor”、排風開關按鈕“Wind-out motor”、紫外燈消毒開關按鈕“Disinfect switch”和電源按鈕“Power supply”，用鑰匙關閉電源，拔下電源線。

　7.7 附：生物安全拒操作面板示意圖

　7.7 維護與保養(yǎng) 7.7.1 每次操作后用 75%的酒精徹底對安全柜內部工作區(qū)域表面、側壁、后壁、窗戶進行表面凈化。切勿使用含有氯的殺菌劑，因為其可能對安全柜的不銹鋼結構造成損壞。同時對紫外燈和電源輸出口表面進行清潔。當清潔安全柜內部區(qū)域時，操作人員除了手放以外，身體的其他任何部位不能進入安全柜。

　7.7.2 每月用濕布對安全柜外部表面進行擦拭，尤其是安全柜的前面和上部，把堆積的灰塵打掃干凈。并檢查所有的維護配件的合理使用情況。

　 7.7.3 紫外燈使用超過 2000 小時后進行紫外燈的更換 7.7.4 每十八個月通知廠家更換高效空氣過濾器，并對生物安全柜進行檢修與維護

　8 8 、P SOP 文件的更改

　該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

　進風 出風 紫外燈 照明 電源

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

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　 文件編號：JYKPCR03001 版本/修訂號：A/0 主題內容 HBV- -A DNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

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　第 14 頁 共 37 頁 乙型肝炎病毒核酸定量檢測標準操作程序 一、 目的

　 規(guī)范乙型肝炎病毒核酸定量檢測的操作。定量檢測臨床血清或血漿樣本中的乙型肝炎（HBV）DNA，用于乙型肝炎的輔助診斷和抗病毒藥物的療效觀察。

　二、方法

　 PCR-熒光探針法 三、原理

　采用核酸釋放劑快速裂解、釋放血清或血漿中的 HBV-DNA，利用針對 HBV 核酸保守區(qū)設計的一對特異性引物、一條特異熒光探針，配以 PCR 反應液，在熒光定量 PCR 儀上，應用實時熒光定量 PCR 檢測技術，通過熒光信號的變化實現 HBV-PCR 的定量檢測。

　四、 標本要求

　4.1 標本類型

　血清或血漿、乳汁 4.2 標本要求 4.2.1 血清標本：無菌采血試管（紅蓋無添加物或黃蓋含促凝劑試管）靜脈采血 2.0ml。室溫放置不超過 4 小時，3000rpm 離心 5 分鐘分離血清，轉移至 1.5ml 滅菌離心管中備用 4.2.2 血漿標本：EDTA 或枸櫞酸鈉抗凝無菌試管靜脈采血 2.0ml，混勻。室溫放置不超過 4小時，3000rpm 離心 5 分鐘分離血清，轉移至 1.5ml 滅菌離心管中備用 4.2.3 乳汁標本：無菌試管采集乳汁 2.0ml。室溫放置不超過 4 小時，3000rpm 離心 5 分鐘分離上清，轉移至 1.5ml 滅菌離心管中備用 4.2.4

　如標本不能當晶檢測，則需將轉移至 1.5ml 滅菌管標本放于-20℃冷凍冰箱內保存，檢測前再復融，標本嚴禁反復凍融 五、儀器

　 上海宏石醫(yī)療科技有限公司 SLAN@ 熒光定量 PCR 擴增儀 六、試劑

　 湖南圣湘生物科技有限公司乙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒

　七、操作程序步驟

　1 7.1 試驗前試劑準備：

　7.1.1 取出包裝盒中的各組分，室溫放置 30 分鐘，待其溫度平衡至室溫后，混勻備用。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03001 版本/修訂號：A/0 主題內容 HBV- -A DNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　15

　第 15 頁 共 37 頁 7.1.2 根據待測樣本、陰性對照、陽性對照以及定量參考品 A~D 數量，按比例（反應液 38ul/人份+酶混合液 2ul/人份）取相應量的反應液、酶混合液，充分混勻成 PCR-mix，瞬時離心后備用。

　7.2

　樣本處理：

　7.2.1 打開電腦 LIS 系統(tǒng)，登錄“免疫組（南院）”選擇儀器“PCR_南院”，選擇當天日期，對標本進行編號，同時對應標本號標本掃條碼或手工輸入病人標本信息。

　7.2.2 按標本要求對標本進行離心分離上清等處理；將陰性對照、陽性對照以及定量參考品A～D 進行瞬時離心，使其溶液沉降至管底。

　7.2.3 選擇相應數量 PCR 反應管，每個 PCR 反應管中加入核酸釋放劑 5ul（深吸淺打，避免出現氣泡），然后分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照以及定量參考品 A～D 各 5ul，吸打 5 次混勻（輕輕吸打，避免出現氣泡）。

　7.2.4 放置 10 分鐘以，每管加入 PCR-mix40ul，蓋上管蓋（可用手指彈擊，去除氣泡）。

　R 7.3

　PCR 擴增

　7.3.1 做好擴增儀檢測前維護，打開擴增儀開關。

　7.3.2 雙擊 SLAN 8.0 圖標，運行擴增儀軟件 7.3.3 菜單新建實驗文件，選擇熒光檢測通道：“通道 1：FAM,SYBR” 7.3.4 點擊熱蓋按鈕，熱蓋完成后，打開擴增儀上蓋，將 PCR 反應管放入擴增儀樣品槽，關閉上蓋。

　7.3.5 編輯擴增模板：按樣本槽內標本編號順序設置樣本、陰性對照、陽性對照、定量參考品，參考品屬性欄內填入對應參考品濃度。

　7.3.6 基因擴增：打開擴增程序，選擇 HBV-DNA 擴增程序文件：“SX-HBV.prg”，然后點擊“開始實驗” 4 7.4 循環(huán)參數設定

　步

　驟 溫度 時間 循環(huán)數 1 UNG 酶反應 50℃ 2 分鐘 1 2 Taq 酶活化 94℃ 5 分鐘 1 3 變性 94℃ 15 秒 45 退火，延伸，及熒光采集 57℃ 30 秒 4 儀器冷卻 25℃ 10 秒 1 7.5 結果分析

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03001 版本/修訂號：A/0 主題內容 HBV- -A DNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　16

　第 16 頁 共 37 頁

　 反應結束后自動保存結果，在實驗結果模塊下，結合模板模式、擴增曲線、標準曲線及報告模式中數據及各曲線，分析反應結果：

　7.5.1 HBV 陰性對照：無 Ct 值顯示，定量結果<250。

　7.5.2 HBV 陽性對照：檢測濃度值介于 1.26×105 ～1.26×10 6 IU/ml。

　7.5.3 四個 HBV 定量參考品：均檢測為陽性，定量濃度值與給定值相符，且標準曲線相關系數 R2 ≥0.98。

　7.5.4 以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

　S 7.6

　LIS 報告

　7.6.1 數據導出：菜單選擇“導出實驗結果”，文件名設為“1”，保存結果 7.6.2

　LIS 傳輸：桌面雙擊“LISMontor.exe”程序，打開 LIS 傳輸程序，點擊“Getlnfo”按鈕，數據傳輸至 LIS 系統(tǒng)中對應的標本號結果中 7.6.3 分析每一個病人結果，回顧近三個月的歷史檢測數據及相關檢測數據，核準結果，發(fā)出檢測報告。

　7.7 關機

　7.7.1

　熱蓋后打開擴增儀上蓋，取出當晶檢測樣本，關閉擴增儀軟件，LIS 軟件，關閉擴增儀電源開關，關閉電腦 7.7.2 整理擴增儀、電腦工作臺面，清潔擴增儀，做好檢測后儀器維護 八、 參考值及檢測限

　試劑盒給出檢測下限為 1.0×102 IU/ml，內標 Ct 的參考值為 40。本實驗室報告下限為<250。

　九、結果解釋

　9.1 對于測定值在 5.0×102 ～5.0×10 9 IU/ml 之間的樣本，且擴增曲線成明顯 S 型，報告相應的測定結果。

　9.2 對于測定值>5.0×109 IU/ml 的樣本，且擴增曲線成明顯 S 型，報告注明>5.0×10 9 IU/ml。若需精確定量可根據結果，將樣本稀釋至 5.0×109 IU/ml 以下再復測。

　9.3 對于測定值≥2.5×102 IU/ml 而<5.0×10 2 IU/ml 的樣本，且擴增曲線成明顯 S 型，表明病毒載量低，可直接報告測定值，但注明：所測定量結果僅供參考。

　9.4 對于測定值<2.5×102 IU/ml 的樣本，則報告 HBV-DNA 含量低于報告下限為<250 十、 備注

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03001 版本/修訂號：A/0 主題內容 HBV- -A DNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　17

　第 17 頁 共 37 頁

　如在檢測工作中出現異常情況，需聯(lián)系儀器及試劑廠家

　上海宏石醫(yī)療科技有限公司：021-65107515

　湖南圣湘生物科技有限公司：073188883176 十一、P SOP 文件的更改

　該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 EV71- -A RNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　18

　第 18 頁 共 37 頁 腸道病毒 1 71 型核酸檢測標準操作程序

　一、 目的

　規(guī)范腸道病毒 71 型核酸定量檢測（PCR-熒光探針法）的操作。定量檢測咽拭子樣本中的腸道病毒 71 型（EV-71）核酸，用于 EV71 感染的輔助診斷。

　二、方法

　 PCR-熒光探針法 三、原理

　針對 EV71 核酸保守區(qū)設計特異性引物和特異性熒光探針，配以 RT-PCR 反應液，在熒光定量 PCR 儀上，應用實時熒光定量 PCR 檢測技術，通過熒光信號的變化實現 EV71-RNA 的定量檢測。

　四、標本要求

　4.1 標本類型

　咽拭子 4.2 標本要求 4.2.1

　標本處理相關耗材要求：1.5ml 離心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、擴增反應管（帶蓋）均需高壓滅菌（121℃，30 分鐘)處理 4.2.2 標本要求：咽拭子標本采樣后，加 2ml 生理鹽水，振蕩器振蕩 1 分鐘混勻，1 小時內檢測。如果 1 小時內無法檢測，則需放于-20℃冷凍箱保存，檢測時復融（只能復溶一次，嚴禁反復凍融）。

　五、儀器

　 上海宏石醫(yī)療科技有限公司 SLAN@ 熒光定量 PCR 擴增儀 六、試劑

　 湖南圣湘生物科技有限公司腸道病毒 71 型（EV71）定量測定試劑盒

　七、操作程序步驟

　1 7.1 試驗前試劑準備：

　7.1.1 取出包裝盒中的各組分，室溫放置 30 分鐘，待其溫度平衡至室溫后，混勻離心備用。

　7.1.2 根據待測樣本、陰性對照、陽性對照數量，按比例（RNA 提取液 1 600ul/人份+EV71內標 1ul/人份）取相應量的 RNA 提取溶液 1 及 EV71 內標，充分混勻成提取試劑 1-mix，瞬時離心后備用。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 EV71- -A RNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　19

　第 19 頁 共 37 頁 7.1.3 根據待測樣本、陰性對照、陽性對照數量，按比例（PCR 反應液 43ul/人份+EV71 酶混合液 2ul/人份）取相應量的 EV71 PCR 反應液及酶混合液，充分混勻 PCR-mix，瞬時離心后備用。

　7.2 樣本處理：

　7.2.1

　打開電腦 LIS 系統(tǒng)，登錄“免疫組（南院）”選擇儀器“PCR_南院”，選擇當天日期，對標本進行編號，同時對應標本號標本掃條碼或手工輸入病人標本信息。

　7.2.2 取適量 1.5ml 滅菌離心管，分別標記樣本編號，陰性對照、陽性對照。每管加入 200ul待測標本及陰、陽性對照，600ul RNA 提取液 1-mix，然后再加入 100ul RNA 提取液 2，震蕩10 秒充分混勻。

　7.2.3 將離心管放入加熱器，58℃放置 10 分鐘，然后置于 2-8℃冰箱內放置 10 分鐘 7.2.4 將離心管瞬時離心（即達到 1000rpm 時立即停止離心），將離心管置于磁珠分離器上3 分鐘（離心管開品面向操作者）

　7.2.5 在磁珠分離器上將離心管內溶液吸出（由上向下，避免碰到離心管壁上的棕色物質）

　7.2.6 每管加入 600ul RNA 提取液 3，然后再加入 200ul RNA 提取液 4，震蕩 10 秒充分混勻 7.2.7 將離心管瞬時離心，將離心管置于磁珠分離器上 3 分鐘 7.2.8 在磁珠分離器上將離心管內溶液吸出（由上向下，避免碰到離心管壁上的棕色物質），靜置 1 分鐘后將管底殘留余液再次吸出丟棄 7.2.9 每個離心管加入 30ul RNA 洗脫液，將離心管壁上的磁珠充分洗脫到管底，吸打混勻 5次，室溫靜置 10 分鐘，然后將離心管再次放置于磁珠分離器上 3 分鐘。

　7.2.10 根據樣本、陰、陽性對照數量選擇相應數量的 PCR 反應管，每個反應管加入 45ul PCR-mix 7.2.11 每個 PCR 反應管內再加入磁珠分離器上離心管內洗脫下的 RNA 混合液（注意不能磁到離心管壁上的磁珠）5ul，最后將 PCR 反應管加蓋 R 7.3 PCR 擴增

　7.3.1 做好擴增儀檢測前維護，打開擴增儀開關 7.3.2 雙擊 SLAN 8.0 圖標，運行擴增儀軟件 7.3.3 菜單新建實驗文件，選擇熒光檢測通道：“通道 1：FAM,SYBR”和“通道 2：HEX,VIC,JOE,TET”

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 EV71- -A RNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　20

　第 20 頁 共 37 頁 7.3.4 點擊熱蓋按鈕，熱蓋完成后，打開擴增儀上蓋，將 PCR 反應管放入擴增儀樣品槽，關閉上蓋。

　7.3.6 編輯擴增模板：按樣本槽內標本編號順序設置樣本、陰性對照、陽性對照、。

　7.3.7 基因擴增：打開擴增程序，選擇 EV71-RNA 擴增程序文件：“SX-EV71.prg”，然后點擊“開始實驗” 4 7.4 循環(huán)參數設定

　步驟 溫度 時間 循環(huán)數 1 預變性和酶激活 95℃ 1 分鐘 1 2 逆轉錄 50℃ 30 分鐘 1 3 cDNA 預變性 95℃ 1 分鐘 1 4 變性 95℃ 15 秒 45 退火，延伸，及熒光采集 30℃ 30 秒 5 儀器冷卻 25℃ 10 秒 1 7.5 結果分析

　反應結束后自動保存結果，在實驗結果模塊下，結合模板模式、擴增曲線及報告模式中數據及各曲線，分析反應結果：

　7.5.1 EV71 陰性對照：無 Ct 值顯示，但內標檢測為陽性，且 Ct 值<37.5。

　7.5.2 EV71 陽性對照：檢測 Ct 值<37.5,內標檢測為陽性，且 Ct 值<37.5。

　7.5.3 每一個檢測樣本的內標檢測為陽性，且 Ct 值<37.5 以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

　S 7.6 LIS 報告

　7.6.1 記錄每一個陽性檢測樣本的 Ct 值，手工輸入 LIS 系統(tǒng)中，陰性檢測樣本，LIS 系統(tǒng)默認為 Ct 值<37.5 7.6.2 核對每一個結果，注意 LIS 系統(tǒng)中是否有歷史結果，回顧性分析檢測結果，核準所有結果，發(fā)出報告 7.7 關機

　7.7.1

　熱蓋后打開擴增儀上蓋，取出當晶檢測樣本，關閉擴增儀軟件，LIS 軟件，關閉擴增儀電源開關，關閉電腦

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 EV71- -A RNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　21

　第 21 頁 共 37 頁 7.7.2 整理擴增儀、電腦工作臺面，清潔擴增儀，做好檢測后儀器維護 八、參考值

　試劑盒給出 EV71 的 Ct 值為 36，檢測內標 Ct 的參考值為 36.本實驗室所定的參考值為:Ct值<37.5 九、結果解釋

　9.1 對于測定 Ct 值<37.5 樣本報告為 EV71-RNA 陽性。

　9.2 對于測定 Ct 值>37.5 或無 Ct 值的樣本，同時內標檢測為陽性，且 Ct 值<37.5，則報告為EV71-RNA 陰性 9.3 當檢測樣本中內標檢測 Ct 值>37.5 時，則該樣本檢測結果無效，需查找并排除原因，并對此樣本進行復檢（如復檢仍無效，則需與試劑廠家聯(lián)系，并保存好當日標本）

　十一、 備注

　如在檢測工作中出現異常情況，需聯(lián)系儀器及試劑廠家 上海宏石醫(yī)療科技有限公司：021-65107515 湖南圣湘生物科技有限公司：073188883176 十一、P SOP 文件的更改

　該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

　永州市中心 醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 HCV- -A RNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　22

　第 22 頁 共 37 頁

　丙型肝炎病毒 A RNA 檢測標準操作程序

　一、目的

　規(guī)范丙型肝炎病毒 RNA 定量檢測（PCR-熒光探針法）的操作。定量檢測臨床血清或血漿樣本中的丙型肝炎病毒（HCV）RNA，用于丙型肝炎的輔助診斷。

　二、方法

　 PCR-熒光探針法 三、原理

　采用磁珠法提取樣品中的丙型肝炎病毒 RNA，利用針對丙型肝炎病毒核酸保守區(qū)設計的特異性引物和熒炮控針，配以 PCR 反應液，在熒光定量 PCR 儀上，應用實時熒光定量 PCR 檢測技術，通過熒光信號的變化實現丙型肝炎病毒 RNA 的定量檢測。

　四、標本要求

　4.1 標本類型

　血清或血漿樣本 4.2 標本要求 4.2.1

　標本處理相關耗材要求：1.5ml 離心管、吸嘴（10ul、200ul、1000ul）、擴增反應管（帶蓋）均需高壓滅菌（121℃，30 分鐘)處理 4.2.2 標本要求：樣本采集后應盡快離心樣本進行檢測，室溫下不超過 4 小時。如果不能即時檢測，需將離心后樣本轉移至滅菌離心管內置于-20℃±5℃冰箱內保存，30 天內檢測完畢。

　五、儀器

　 上海宏石醫(yī)療科技有限公司 SLAN@ 熒光定量 PCR 擴增儀 六、試劑

　 湖南圣湘生物科技有限公司腸道病毒丙型肝炎病毒 RNA 定量測定試劑盒

　七、操作程序步驟

　1 7.1 試驗前試劑準備：

　7.1.1 取出包裝盒中的各組分，室溫放置 30 分鐘，待其溫度平衡至室溫后，混勻離心備用。

　7.1.2 根據待測樣本、陰性對照、陽性對照及參考品數量，按比例（RNA 提取液 1 600ul/人份丙型肝炎病毒內標 0.4ul/人份）取相應量的 RNA 提取溶液 1 及丙型肝炎病毒內標，充分混勻成提取試劑 1-mix，瞬時離心后備用。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 HCV- -A RNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　 23 第 23 頁 共 37 頁 7.1.3 根據待測樣本、陰性對照、陽性對照及參考品數量，按比例（PCR 反應液 49ul/人份+增強劑 1ul/人份）取相應量的丙型肝炎病毒 PCR 反應液及 RT-PCR 增強劑，充分混勻 PCR 混合液，瞬時離心后備用。

　7.2 樣本處理：

　7.2.1

　打開電腦 LIS 系統(tǒng)，登錄“免疫組（南院）”選擇儀器“PCR_南院”，選擇當天日期，對標本進行編號，同時對應標本號標本掃條碼或手工輸入病人標本信息。

　7.2.2 取適量 1.5ml 滅菌離心管，分別標記樣本編號，陰性對照、陽性對照及參考品。每管加入 200ul 待測標本及陰、陽性對照及參考品，600ul RNA 提取液 1-mix，然后再加入 100ul RNA 提取液 2，震蕩 10 秒充分混勻后室溫靜置 30 分鐘。

　7.2.3

　將離心管瞬時離心（即達到 1000rpm 時立即停止離心），將離心管置于磁珠分離器上3 分鐘（離心管開品面向操作者）

　7.2.4 在磁珠分離器上將離心管內溶液吸出（由上向下，避免碰到離心管壁上的棕色物質）

　7.2.5 每管加入 600ul RNA 提取液 3，然后再加入 200ul RNA 提取液 4，震蕩 10 秒充分混勻 7.2.6 將離心管瞬時離心，將離心管置于磁珠分離器上 3 分鐘 7.2.7 在磁珠分離器上將離心管內溶液吸出（由上向下，避免碰到離心管壁上的棕色物質），靜置 1 分鐘后將管底殘留余液再次吸出丟棄 7.2.8 每個離心管加入 50ul PCR 混合液，將離心管壁上的磁珠充分洗脫到管底，吸打混勻。蓋上管蓋，上機檢測 R 7.3 PCR 擴增

　7.3.1 做好擴增儀檢測前維護，打開擴增儀開關 7.3.2 雙擊 SLAN 8.0 圖標，運行擴增儀軟件 7.3.3 菜單新建實驗文件，選擇熒光檢測通道：“通道 1：FAM,SYBR” 7.3.4 點擊熱蓋按鈕，熱蓋完成后，打開擴增儀上蓋，將 PCR 反應管放入擴增儀樣品槽，關閉上蓋。

　7.3.6 編輯擴增模板：按樣本槽內標本編號順序設置樣本、陰性對照、陽性對照、參考品及其屬性（即參考品濃度）。

　7.3.7 基因擴增：打開擴增程序，選擇丙型肝炎病毒 RNA 擴增程序文件：“SX-HCV.prg”，

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 HCV- -A RNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　 24 第 24 頁 共 37 頁 然后點擊“開始實驗” 4 7.4 循環(huán)參數設定

　步驟 溫度 時間 循環(huán)數 1 預變性和酶激活 95℃ 1 分鐘 1 2 逆轉錄 60℃ 30 分鐘 1 3 cDNA 預變性 95℃ 1 分鐘 1 4 變性 95℃ 15 秒 45 退火，延伸，及熒光采集 30℃ 30 秒 5 儀器冷卻 25℃ 10 秒 1 7.5 結果分析

　反應結束后自動保存結果，在實驗結果模塊下，結合模板模式、擴增曲線及報告模式中數據及各曲線，分析反應結果：

　7.5.1 HCV 陰性對照：無 Ct 值顯示，但內標檢測為陽性，且 Ct 值<38。

　7.5.2 HCV 陽性對照：檢測濃度值范圍為：1.58E+02-1.58E+03IU/mL。

　7.5.3 每一個檢測樣本的內標檢測為陽性，且 Ct 值<38 以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

　S 7.6 LIS 報告

　7.6.1 記錄每一個陽性檢測樣本的 Ct 值，手工輸入 LIS 系統(tǒng)中，陰性檢測樣本，LIS 系統(tǒng)默認為檢測結果低于檢測下限，即<25. 7.6.2 核對每一個結果，注意 LIS 系統(tǒng)中是否有歷史結果，回顧性分析檢測結果，核準所有結果，發(fā)出報告 7.7 關機

　7.7.1

　熱蓋后打開擴增儀上蓋，取出當晶檢測樣本，關閉擴增儀軟件，LIS 軟件，關閉擴增儀電源開關，關閉電腦 7.7.2 整理擴增儀、電腦工作臺面，清潔擴增儀，做好檢測后儀器維護 八、參考值

　試劑盒給出檢測下限為 25IU/mL，內標 Ct 參考值為≤38

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 HCV- -A RNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　 25 第 25 頁 共 37 頁 九、結果解釋

　9.1 對于測定值在 5.0×102 ～1.0×10 8 IU/ml 之間的樣本，且擴增曲線成明顯 S 型，報告相應的測定結果。

　9.2 對于測定值>1.0×108 IU/ml 的樣本，且擴增曲線成明顯 S 型，報告注明>1.0×10 8 IU/ml。若需精確定量可根據結果，將樣本稀釋至 1.0×108 IU/ml 以下再復測。

　9.3 對于測定值≥2.5×102 IU/ml 而<5.0×10 1 IU/ml 的樣本，且擴增曲線成明顯 S 型，表明病毒載量低，可直接報告測定值，但注明：所測定量結果僅供參考。

　9.4 對于測定值<2.5×102 IU/ml 的樣本，則報告 HCV-DNA 含量低于報告下限為<25. 十二、 備注

　如在檢測工作中出現異常情況，需聯(lián)系儀器及試劑廠家 上海宏石醫(yī)療科技有限公司：021-65107515 湖南圣湘生物科技有限公司：073188883176 十一、P SOP 文件的更改

　該標準操作程序的更改，可由任一使用本程序的操作人員提出并報請專業(yè)主管進行修改，科主任審核簽字后生效。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 HPV- -A DNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　26

　第 26 頁 共 37 頁

　高危型 人乳頭狀瘤病毒（ HPV ）核酸檢測

　 1 目的：

　規(guī)范臨床基因擴增實驗室對臨床標本的處理，提高檢測結果的準確率。

　2 適用范圍：

　14 種高危型人乳頭狀瘤病毒（HPV）核酸檢測試劑盒。

　3 職責：

　由臨床基因擴增實驗室專業(yè)技術人員制定程序文件，實驗室負責人審核，檢驗所總負責人批準實施。

　4 檢測原理：

　本試劑盒基于采用 Taqman 熒光探針結合多重熒光 PCR 技術，通過實時熒光 PCR 儀，進行同步核酸擴增與檢測�？稍谕�一反應管中通過儀器四種熒光檢測通道分別檢測 12 種高危型 HPV（31， 33， 35， 39， 45， 51， 52， 56， 58， 59， 66， 68），HPV16、HPV18及細胞內對照 β-globin DNA。細胞內對照 DNA 用于評估樣本質量及 PCR 抑制因素。

　5 適用標本類型：

　本試劑盒適用于男性泌尿生殖道分泌物或者女性尿道分泌物的棉拭子、女性宮頸脫落細胞樣本以及男女性疣體的樣本。

　6 標準操作程序：

　6.1 擴增試劑準備 6.1.1 從-20℃保存的試劑盒中取出 PCR MIX，4℃避光下平緩解凍，上下顛倒混勻后，點動離心；將-20℃保存的 Taq 酶管取出必須點動離心。

　6.1.2 建議對 48 人份/盒擴增檢測試劑進行一次性分裝。將 Taq 酶全部加入到 PCR MIX 中去，并再吸取 PCR MIX 到 Taq 酶管里潤洗 2 遍，保證 Taq 酶盡可能多的加到 PCR MIX 中。充分震蕩混勻 PCR MIX，在微型離心機上點動離心備用。

　永州市中心醫(yī)院南院檢驗科 R PCR 實驗室

　作業(yè)指導書

　 文件編號：JYKPCR03002 版本/修訂號：A/0 主題內容 HPV- -A DNA 檢測標準操作程序

　生效日期：20151010

　27

　第 27 頁 共 37 頁

　6.1.3 取出 48 人份 PCR 八聯(lián)管或者單管，在 PCR 管架上進行排列，將移液器調至 18ul 后將混合好的 PCR 反應液分裝到 0.2ml PCR 管中。取出當天需要的實驗的數量，通過傳遞窗傳送到標本制備區(qū)，放于 4℃冰箱備用，其余的放入-20℃的試劑準備區(qū)的冰箱保存?zhèn)溆茫ㄔ噭┍M量避光，勿多次反復凍融）。

　注：如需要每次單獨分裝的，可參照以下附表計算使用量，但需要在計算后的基礎上增加 1%—2%的消耗量。

　PCR-Mix DNA Taq 1 人份用量 17.5μl 0.5 μl 10 人份用量 175 μl 5 μl 20 人份用量 350 μl 10 μl 48 人份用量 840 μl 24μl 6.2 宮頸脫落細胞 DNA 的提�。�

　6.2.1 將臨床樣本震蕩混勻，伸入采集管底部吸取臨床樣本 0.5ml-1ml 至 1.5ml 的離心管中。（如果細胞數量少可以加大體積到 2ml。）

　6.2.2 14000 轉/分鐘離心 1 分鐘（此 1 分鐘應為有效的離心時間，若升降速率較慢的離心機應相應增加離心時間），棄上清（可保留殘液約 20μl）。

　6.2.2.1 對于血較多的臨床標本，取細胞前在震蕩器上震蕩時間長些，離心收集細胞后，再用生理鹽水多洗一次。

　6.2.2.2 對于黏液過多的臨床標本，去細胞前在震蕩器上震蕩的時間長些，不要取黏液，將取樣刷頭取出，吸取瓶底部液體。另要求醫(yī)生在取樣時盡量規(guī)范，先用棉簽把黏液擦去再進行取樣。

　6.2.3 加入 0.5ml 細胞保存液振蕩重懸細胞，14000 轉/分鐘離心 1 分鐘（此 1 分鐘應為有效的離心時間，若升降速率較慢的離心機應相應增加離心時間），盡量去盡全部上清。

　6.2.4 每樣本加入 50ul 細胞裂解液，充分震蕩重懸細胞，煮沸 10 分鐘。

　6.2.5 14000 轉/分鐘離心 10 分鐘，取上清（上清中為...

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